Aplicación del test de endósmosis en semen de carnero preservado en condiciones de campo

Melina Castillo

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Tesis presentada para optar al título de Magister en Biotecnología
Director: Dr. HUMBERTO CISALE
Co-directora: Dra. MARÍA BETTINA GÓMEZ
Lugar de trabajo: Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLPam.
Ciudad de Buenos Aires, 2021.

Universidad Nacional de La Pampa
Facultad de Ciencias Económicas y Jurídicas
Maestría en Gestión de Empresas
Director: Mg. Paturlanne, Jorge Luis
Co director: Mg. Draque, Sergio
Fecha: 21/07/2022.

Primera edición - EPUB2.0 - ISBN 978-950-863-490-0
Editorial EdUNLPam - 04.05.2021

Ficha de catalogación

Agradecimientos

A mis padres Graciela y Hugo por su apoyo, siempre incondicionales conmigo.

A Bettina Gómez y Dante Cerutti, mis compañeros en la filosofía que motiva el desarrollo de nuestra profesión, ambos fundamentales en este trabajo. Con ellos, a este equipo que teje alas que desplegamos todos, leales al encuentro de logros que solo satisfacen en compañía. Gratitud inmensa para con ustedes familia Amiga.

A establecimiento Cumecó en Speluzzi, La Pampa de Ana Frola, Roberto Gómez y familia, que dio lugar a este trabajo, apoyo logístico y moral.

A Adriana Garro que me enseña siempre, me dio sus votos de confianza y gran apoyo para que mi estudio sea posible.

A Humberto Cisale que dirigió este trabajo con labor real, dedicada y calidez humana.

A los productores ovinos del norte de La Pampa por su gran predisposición para colaborar con sus animales.

A Guillermo Meglia y Marcelo Gastaldo de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Pampa, por brindarnos espacio, compartirnos sus laboratorios y elementos para realizar las observaciones de las muestras. También por sus visitas y su incentivo.

A las cátedras de Biología General e Inmunología Especial de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional de La Pampa, por conceder parte de mi dedicación al estudio.

A mis colegas y Amigos Laura Ocampo y Rodolfo Telechea por su compañía y colaboración a la causa, contactando productores y consiguiendo carneros para el estudio.

A mis Amigos, lo mejor que cultivo. Por interesarse en lo que hago y colaborarme siempre en muchos sentidos.

Aplicación del test de endósmosis en semen de carnero preservado en condiciones de campo

Resumen

La obtención y fraccionamiento de semen de carneros permite la multiplicación y difusión de genes deseables además de preservar su integridad como recurso reproductivo. La evaluación del semen es indispensable para estimar su capacidad fecundante, y así poder determinar su aptitud para su utilización y para la preservación. Los parámetros de laboratorio objetivos en el manejo de semen de carnero son escasos. El Test de Endósmosis está orientado a estimar el potencial de la capacidad fecundante del semen ya que posibilita la evaluación de la funcionalidad de la membrana. En ovinos no fue posible ponderar su aplicabilidad a campo, quedando por analizar la relación entre la información que brinda este test con las condiciones del semen para su preservación. El objetivo de este estudio fue evaluar la posible correlación del Test de Endósmosis con parámetros de calidad de semen ovino antes y después de su preservación, y determinar la eficacia de esta prueba en predecir la aptitud del semen para la preservación. El estudio se realizó en el norte de La Pampa, Argentina. Se incluyeron 20 carneros de las denominaciones raciales Corriedale (n= 8), Texel (n= 8) y Pampinta (n= 4), en edad reproductiva, mantenidos en pastoreo. Los animales se encontraban en unidades productivas próximas a los 35° de latitud sur, de características ambientales y productivas semejantes. Para el muestreo se utilizó electroeyaculador y se evaluaron: motilidad espermática, concentración espermática, vitalidad, morfología e integridad de la membrana plasmática en semen fresco, refrigerado y congelado. La funcionalidad de membrana se evaluó objetivamente con el Test de Endósmosis, y se clasificó a los carneros de acuerdo con los valores de éste en semen fresco. Se observó correlación media de la motilidad espermática del semen fresco con el porcentaje de espermatozoides positivos al Test de Endosmosis del semen refrigerado (r= 0,54) y descongelado (r= 0,60). Respecto a esta última variable en el semen refrigerado, permite apreciar las diferencias de respuesta a la prueba, en referencia a la clasificación por valores de las muestras frescas respectivas (p < 0,05), mientras que en el semen congelado no demostró diferencias significativas al respecto (p < 0,05). Considerando los protocolos utilizados, es posible inferir una correlación entre Test de Endósmosis para el semen refrigerado y el semen fresco, no así con el semen criopreservado.

Palabras clave: Ovinos, Reproducción, Test hipoosmótico, Criopreservación

Application of the endosmosis test in rams semen preserved in field conditions

Summary

The obtention and fractioning of semen of genetically superior animals allows to multiplicate and disseminate of desirable genes, besides preserving the integrity as a reproductive resource. The evaluation of semen is essential to estimate its fertilization capacities, as such determine its aptitude to both utilization and preservation. The objective parameters to assess ram’s semen are scarce. The Hypoosmotic Swelling test is focused on estimate the potential of the semen fertilizing capacity to evaluate the membrane functionality. Nevertheless, in ovine was not possible to analyze its use at field condition so that remains to investigate the relationship between the information that provides the test with the semen condition for its preservation. The aim of the present work was to evaluate the correlation of the endosmosis test with quality parameters of ram´s semen before and after its preservation and define the efficacy of this test to predict the semen aptitude for its preservation. The study was carried out in the north of La Pampa province, Argentina. Twenty rams of the breeds Corriedale (n= 8), Texel (n= 8) and Pampinta (n= 4), on their reproductive age, were enrolled in the project. The animals were kept under grazing condition on farms, close to each other, at 35° south latitude, with similar environmental and productive characteristic. Semen samples were obtained by electroejaculation and the following parameters were assessed: sperm concentration and motility, sperm vitality, morphology, and integrity of the plasmatic membrane on fresh, chilled, and frozen samples. The membrane function was objectively evaluated by the Hypoosmotic Swelling test, and the rams were classified according to their values on fresh semen. A mean positive correlation was observed between fresh semen sperm motility with the percentage of positive sperm to the endosmosis test with both refrigerated (r= 0,54) and thawed (r= 0,60) semen. Regarding this last variable, differences in response to the test were found in refrigerated semen, in reference to the values found of the respective fresh samples (p < 0,05). Frozen semen did not show significant differences. (p < 0,05). Considering the protocols used, it was concluded that a positive correlation between the endosmosis test exists in fresh and chilled semen, but not in the cryopreserved one.

Keywords: ovine, reproduction, Hypoosmotic Swelling test, cryopreservation

Capítulo I. Introducción

El desarrollo de la biotecnología está ligado al progreso tecnológico que incluye al sector agrícola-ganadero proporcionando ventajas competitivas al mismo. Dentro de la biotecnología animal, las biotecnologías aplicadas a la reproducción comprenden variadas técnicas cuyo objetivo es incrementar la eficiencia reproductiva. Comprenden desde la inseminación artificial, criopreservación de semen, ovocitos y embriones, sincronización e inducción de la ovulación, fertilización in vitro, producción de embriones in vitro, transferencia de embriones, sexado de espermatozoides y embriones, hasta la clonación y transgénesis. Estas biotecnologías reproductivas tienen un gran impacto en las especies animales destinadas a la producción, ya que permiten incrementar los indicadores reproductivos del ganado y en consecuencia los indicadores de producción (Biotecnología. Boletín Estadístico y Tecnológico, 2010; Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva de la Nación, 2019).

En el caso de la producción ovina, la obtención y el fraccionamiento del semen de un carnero genéticamente superior, permite acelerar el mejoramiento de las características productivas de las majadas, aumentando la efectividad del carnero al lograr un mayor número de crías respecto a las que se obtendrían con servicio natural, además de preservar la integridad del mismo como recurso reproductivo (Gibbons y Cueto, 2011). Las técnicas de conservación de semen por períodos prolongados posibilitan la multiplicación y difusión de genes deseables. La evaluación del semen es una condición indispensable para estimar su capacidad fecundante, y así en consecuencia determinar su aptitud para la utilización y preservación. Los parámetros que se utilizan de rutina son de carácter macroscópico (color, aspecto, volumen, pH); y microscópicos (motilidad masal, concentración espermática, motilidad espermática, vitalidad y morfología), siendo en su mayoría subjetivos (Aisen, 2004a; Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

En la práctica habitual, la preservación de semen por refrigeración o congelación se realiza mediante un proceso manual. Este implica la utilización de diluyentes que varían en su composición y son de origen artesanal o comercial, y en el caso de la congelación, ambos con incorporación de yema de huevo. Lograr las curvas de descenso de temperatura para el enfriamiento implica la manipulación del medio donde se coloca el semen y de heladeras domésticas, del mismo modo ocurre para la congelación ya que se utilizan recipientes con diferentes niveles de nitrógeno, a cuyos vapores se exponen las pajuelas por un tiempo determinado, que no va más allá de unos minutos. Existen diferentes protocolos para criopreservar el semen de carnero y cada uno considera los conocimientos generales de requerimientos del semen respecto del diluyente, crioprotectores, concentración de sustancias y de espermatozoides, rango de descenso de temperatura y tiempos en que el mismo se sucede, compatibles con la supervivencia de la célula espermática (Aisen, 2004b; Palma, 2007; Cueto et al., 2011; información anecdótica).

Cada protocolo de preservación de semen, varía en función del diseño práctico y de los resultados obtenidos. Los mismos difieren en la dilución, de acuerdo al diluyente empleado, si se incorpora en una sola etapa a temperatura ambiente o en más etapas incluyendo el enfriamiento. Esto repercute en el envasado que se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o en heladera. También se emplean recipientes con superficies diferentes, así como los niveles de nitrógeno para congelar. Cada uno adapta un diseño de protocolo de preservación (Aisen, 2004b; Palma, 2007; Cueto et al., 2011; información anecdótica).

Si bien los parámetros que se utilizan rutinariamente para la evaluación seminal son en su mayoría subjetivos, también existen pruebas orientadas a estimar el potencial de la capacidad fecundante. Entre ellas, el Test Hipoosmótico o Test de Endósmosis (HOST), fue inicialmente desarrollado y aplicado en semen humano para la evaluación de la integridad funcional de la membrana plasmática de los espermatozoides. Esta prueba se basa en analizar el desequilibrio osmótico entre el medio extracelular e intracelular, que se produce al enfrentar a los espermatozoides con un medio hipoosmótico, provocando en el espermatozoide funcionalmente normal una dilatación y enrollamiento del flagelo (Jeyendran et al., 1984).

Debido a las particularidades de los espermatozoides en las distintas especies y a las diferencias en el comportamiento de sus membranas, fue necesario determinar la solución hipoosmótica con mayor efecto sobre los espermatozoides de cada una para la aplicación del Test de Endósmosis y estandarizar las condiciones de la prueba respectivamente (Vásquez et al., 2011). Dicha prueba se ha aplicado en el semen humano (Jeyendran et al., 1984), bovino (Correa y Zavos, 1994), canino (Rodríguez-Gil et al., 1994), equino (Caiza de la Cueva, 1998), porcino (Gadea et al., 1998) y camélidos sudamericanos (Giuliano et al., 2006).

Para la estandarización del Test de Endósmosis en el ovino se han analizado la composición de las soluciones utilizadas (sales, azúcares), su osmolaridad, el tiempo de exposición y la correlación con otros parámetros seminales (Rivolta et al., 1995; Oberst et al., 2003; Santiani et al., 2004; Oliveira Moura et al., 2010; Vázquez, et al., 2011; Hernández y Carrillo González, 2015). No obstante, no se ha ponderado la posibilidad de aplicar esta técnica en condiciones de trabajo a campo, como así tampoco la relación de los resultados de la misma en ese contexto y las condiciones del semen luego del proceso de preservación. Esta información permitiría analizar su valor como herramienta para tomar decisiones productivas en la evaluación de reproductores a campo, especialmente en la época de servicio.

I.1. Hipótesis general de trabajo

El Test de Endósmosis brinda información para inferir las condiciones que tiene el semen para su preservación.

I.2. Objetivo general de trabajo

Evaluar la correlación del Test de Endósmosis con otros parámetros de calidad de semen ovino antes y después de su preservación y determinar la aplicabilidad de esta prueba en la predicción de la aptitud del semen para la preservación a campo.

Capítulo II. Marco teórico

II. 1. Producción espermática del ovino

Los carneros alcanzan la madurez sexual en la pubertad, se produce entre los 5 y 7 meses de edad y cuando el animal tiene entre 50-60% de su peso adulto. La producción espermática continuada en ovinos o espermatogénesis, comprende una serie de divisiones y diferenciación celular. Lleva alrededor de 49 días (Folch, 2000; Hafez, 2002).

El tiempo necesario para el desarrollo de las células espermáticas es constante y no puede ser acelerado por ningún estímulo hormonal, alimentación o ritmo de eyaculación. La producción espermática está relacionada al volumen testicular. Un carnero produce diariamente unos 20 millones de espermatozoides por gramo de testículo (Hafez, 2002; Beltrán de Heredia, 2009).

Durante su tránsito y almacenamiento en el epidídimo y posterior transporte a través del tracto reproductor de la hembra, los espermatozoides experimentan una secuencia de cambios morfológicos, bioquímicos y cinemáticos por los cuales adquieren su capacidad fecundante (Cooper, 1986; Hafez, 2002).

Durante la maduración espermática en el epidídimo los cambios morfológicos que se producen son, en la mayoría de las especies, la migración de la gota citoplasmática de proximal a distal y la posterior eliminación de la misma del flagelo. También hay cambios de tamaño y forma de los espermatozoides (Soler et al., 2000; Hafez, 2002).

En el núcleo de los espermatozoides se incrementa la estabilidad de la cromatina por el aumento progresivo de puentes disulfuro (-S-S-) entre las protaminas del ADN ricas en cisteínas (Yanagimachi ,1994; Galaz-Leiva et al., 2012).

Algunos componentes de la cola del espermatozoide también se estabilizan mediante puentes disulfuro, lo que puede condicionar las características del movimiento del espermatozoide maduro (Glover, 1990).

Durante la maduración espermática, los espermatozoides también sufren cambios bioquímicos en todos sus compartimentos. Las mayores modificaciones se producen en la membrana plasmática. Dado que la composición química y osmolaridad del fluido secretado por el epidídimo es diferente en sus distintas porciones, los cambios se producen en la membrana plasmática durante el tránsito del espermatozoide por dichas porciones del epidídimo. La acción de sustancias secretadas por el epitelio epididimario como proteínas, carnitina, ácido siálico e iones inorgánicos, entre otros, modifica la cubierta glicoproteica. La cantidad y composición de los lípidos de la membrana espermática también varía y aumenta la cantidad de colesterol (Yanagimachi, 1994; Hafez, 2002). Esta fase de maduración de los espermatozoides en el epidídimo del carnero suele durar 14 días (Aisen, 2004b).

La hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH) es sintetizada en el hipotálamo y actúa en la fisiología del macho elevando las hormonas folículo estimulante (FSH) y luteinizante (LH) en la hipófisis, las cuales tienen un efecto directo sobre la espermatogénesis y la secreción de testosterona (Hafez, 2002).

En el caso del carnero, la producción espermática y su capacidad para realizar la monta se mantiene durante todo el año, con fluctuaciones en la capacidad reproductiva (Boland et. al., 1985). La temperatura del testículo es unos 5 ºC inferior a la temperatura corporal. Cuando esta se altera, por ejemplo, como consecuencia del calor, fiebre o estrés, la espermatogénesis es afectada, presentándose incremento de las anomalías espermáticas, disminución de la producción y capacidad fecundante; dependiendo de la intensidad de la temperatura y de la duración en el tiempo que tenga puede llegar a la esterilidad de los carneros (Colas, 1980; Delgadillo, 2004).

En el ovino se ha evidenciado que tanto el comportamiento sexual como la calidad seminal varían en función de la edad y raza. Los parámetros seminales evolucionan de acuerdo a la edad de los animales (Aisen, 2004a; Beltrán de Heredia, 2009).

II.2. Análisis de semen ovino

Las técnicas de evaluación de semen para determinar sus aptitudes en la práctica reproductiva, aún se basan en un análisis seminal rutinario clásico, que tiene valor limitado para predecir la subsiguiente fertilidad de la muestra (Aisen, 2004a; Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

Luego de la criopreservación, tras la descongelación, el conocimiento de la calidad seminal permitiría determinar el rendimiento de los machos al respecto y por tanto planificar la preservación de su semen (Aisen, 2004a; Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

II.2.1. Parámetros macroscópicos

II.2.1.1. Color

La cantidad de espermatozoides del eyaculado contribuye a que éste adquiera coloración, siendo blanco-amarillento compatible con una buena concentración y más blanquecina cuando esta es menor. Se admite una relación directa entre la intensidad del color y la concentración espermática (Pérez y Pérez, 1985; Hafez, 2002).

Un color rojizo es compatible con la presencia de sangre, así como los colores en escala de gris o marrón indican contaminación, infección o presencia de orina. En estos casos la muestra debe desecharse (Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

II.2.1.2. Consistencia

La relación de la concentración de espermatozoides y la calidad del plasma seminal, le confieren al semen su aspecto. Las muestras de mayor consistencia que se observan cremosas, contienen más espermatozoides que las muestras de menor consistencia que son más acuosas. El semen debe tener un aspecto cremoso-lechoso y uniforme (Evans y Maxwell, 1990).

II.2.1.3. Volumen

El volumen del eyaculado se admite como normal en un rango de 0,5 a 2,0 ml con una media de 0,8 ml. Además, es conocido que las cópulas reiteradas a intervalos demasiado cortos disminuyen el volumen recolectado y que la excitación acentuada, lo aumentan (Pérez y Pérez, 1985).

Normalmente se obtienen eyaculados de aproximadamente 1 ml. Este volumen, varía según la edad, tamaño y condición corporal del animal, frecuencia de colección y destreza del operador (Cueto et al., 2011; Gibbons y Cueto, 2011).

II.2.2. Parámetros microscópicos

II.2.2.1. Motilidad espermática

La evaluación de la motilidad es uno de los parámetros más utilizados, dado que es relativamente sencillo de obtener. La motilidad es necesaria para que los espermatozoides se transporten en el tracto reproductivo de la hembra y para atravesar las cubiertas del ovocito. Se evalúa subjetivamente, incluyendo motilidad masal y motilidad individual progresiva, u objetivamente mediante sistemas computacionales (Computer Assisted Sperm Analysis - CASA). En el análisis de semen de rumiantes menores es empleada la motilidad masal, que refleja el movimiento de las células espermáticas en su conjunto. Se determina utilizando una gota de semen puro pequeña colocada sobre un portaobjeto temperado a 37 °C, con microscopio óptico a 100 aumentos (100x). Esta valoración requiere de una concentración espermática elevada para que las ondas y remolinos se visualicen. Se clasifica en base a una escala de cinco grados (Pérez y Pérez, 1985; Evans y Maxwell,1990; Padrón et al., 1998; Aisen, 2004a).

La motilidad individual se obtiene, con una gota de semen diluida dispuesta en portaobjeto con cubreobjeto, utilizando un microscopio óptico a 400 aumentos (400x). Es una valoración del porcentaje de espermatozoides motiles y de espermatozoides con movimiento progresivo. Se recomienda utilizar semen con una motilidad individual progresiva no inferior al 70% (Aisen, 2004a; Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

Los diferentes sistemas CASA que existen son automáticos, objetivos y estandarizados, para la evaluación de parámetros seminales. Los principios básicos utilizados para el análisis de las imágenes digitalizadas son similares, pero hay diferencias en sus sistemas ópticos, técnicas de captura de imagen, reconocimiento espermático y algoritmos utilizados para la reconstrucción de trayectorias y determinación de las medidas cinéticas, como así también en el manejo y análisis de los datos (Mortimer, 2000; Verstegen et al., 2002).

II.2.2.2. Concentración espermática

La concentración espermática está dada por el número de espermatozoides por unidad de volumen (millones espermatozoides/ml de eyaculado). Se utilizan diferentes métodos para su cálculo que varían en función de la rapidez y exactitud (Evans y Maxwell, 1990).

En general la concentración espermática varía entre 2-5.109 espermatozoides/ml. Entre los métodos para determinarla están el recuento en cámara de Neubauer y el método fotocolorimétrico. Aunque ambos son precisos y, si bien el fotocolorímetro permite un recuento más rápido, su costo es más elevado que la cámara de Neubauer (Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

II.2.2.3. Vitalidad

La membrana celular intacta de los espermatozoides impide el pasaje de ciertos colorantes al medio intracelular, lo cual es indicación de vitalidad. Por el contrario, los espermatozoides muertos permiten el ingreso de estas moléculas. Existe una serie de técnicas destinadas a identificar espermatozoides vivos y muertos, como la tinción Eosina-Nigrosina (Colas, 1975; Colas, 1980) y Azul de Tripán (Suttiyotin y Thwaites, 1992). Se recomienda utilizar en semen con un porcentaje de espermatozoides muertos no mayor al 30% (Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

II.2.2.4. Morfología

Un espermatozoide normal de carnero, presenta apariencia simétrica con cabeza oval de contorno regular. La cabeza tiene una longitud de 8,8 a 9,8 µm y ancho de 4,8 a 6,01 µm (Gravance et al.,1998; Langeveldt, 2016). La pieza intermedia es recta y de contorno regular, alineada con el eje longitudinal de la cabeza y tiene una longitud de 7 a 8 µm. La cola es única, delgada, no enrollada y de contorno irregular, tiene una longitud de 60 µm (Ávalos Rodríguez, et al., 2018). Al teñir el espermatozoide, se observan zonas bien definidas: la zona acrosómica que cubre más de la tercera parte de la cabeza y la sub acrosómica que cubre el resto de la cabeza (Ávalos Rodríguez, et al., 2018).

Las anormalidades de los espermatozoides se clasifican en anormalidades primarias que se producen durante la espermatogénesis y pueden ocurrir en el acrosoma (pérdida del borde apical, borde abultado, arrugado, incompleto, o doblado), en la cabeza (piriforme, lanceolada, irregular, angosta, cabeza doble, macrocéfalo, microcéfalo), en el cuello (fractura, presencia de gota citoplasmática) y en la cola (corta, doble, enrollada, presencia de gota citoplasmática). Las anormalidades secundarias ocurren durante el transporte de los espermatozoides desde el túbulo seminífero y/o epidídimo hasta su salida por la uretra durante la eyaculación. Implican cabezas desprendidas, acrosoma desprendido, colas retorcidas e inespecíficas por noxa (Evans y Maxwell, 1990; Palma, 2007).

Para realizar este análisis hay diferentes tinciones, cuya observación se realiza en un microscopio óptico, como tinciones simples Eosina-Nigrosina, Azul de Metileno, Rosa de Bengala o Hematoxilina, que se distribuyen homogéneamente en el interior celular, permitiendo diferenciar el contorno del espermatozoide, con un buen contraste con el fondo del campo visual. También existen tinciones dobles como Giemsa, William o Papanicolau, que buscan visualizar partes específicas del espermatozoide (García Artiga et al., 1994).

Para este examen se utiliza también una gota de semen en solución de formol-citrato para observación en microscopio de contraste de fase a 400 aumentos (400x) o con lente de inmersión (1000x) (Palma, 2007).

Se han desarrollado sistemas informatizados que permiten el análisis objetivo de la morfología/morfometría principalmente de la cabeza del espermatozoide (Ramos et al., 2002).

En las especies de interés ganadero, los colorantes empleados han sido diversos; en la especie ovina la Hematoxilina sola mostro resultados superiores cuando los extendidos se analizaron con el sistema CellMorf® (Gravance et al., 1998).

Un eyaculado de carnero se considera normal cuando el porcentaje de formas anormales es inferior al 15%. Pueden existir variaciones en la morfología espermática debido al estrés ambiental, factor individual, temperatura, estación del año, etc. (Gibbons, 2004).

II.2.2.5. Test de Endósmosis (HOST)

El Test Hipoosmótico o Test de Endósmosis (HOST) fue inicialmente desarrollado y aplicado en semen humano para la evaluación de la integridad funcional de la membrana plasmática de los espermatozoides. En esta prueba se incuba el semen en un medio hipoosmótico, que produce un desequilibrio osmótico entre el medio extracelular e intracelular, provocando en el espermatozoide funcionalmente normal una dilatación y enrollamiento del flagelo a consecuencia del ingreso y acumulación de agua en el mismo. Los espermatozoides cuya membrana posea un daño físico o funcional, no experimentan dicho cambio (Jeyendran et al., 1984).

La prueba HOST se utiliza para análisis de membranas de espermatozoides de distintas especies, por lo que, debido a las diferencias en el comportamiento, fue necesario estandarizar las condiciones de la prueba para cada una (Vásquez et al., 2011). Dicha prueba se ha aplicado en el semen bovino (Correa y Zavos, 1994), canino (Rodríguez-Gil et al., 1994), equino (Caiza de la Cueva, 1998), porcino (Gadea et al., 1998) y en camélidos sudamericanos (Giuliano et al., 2006). En general, se incuba la muestra de semen durante 30 a 60 minutos en un medio con una presión osmótica entre 50 y 150 mOsm/L a 37 ºC y luego se observan 200 espermatozoides. Los valores obtenidos en esta prueba se correlacionan con otros parámetros de calidad seminal como la motilidad, la viabilidad y la morfología (Jeyendran, et al., 1984; Correa y Zavos, 1994; Rodríguez-Gil, et al., 1994; Caiza de la Cueva, 1998; Gadea, et al., 1994; Giuliano et al., 2006).

El HOST presenta una correlación elevada con el test de penetración en ovocitos de hámster en semen humano (Jeyendran et al., 1984). En humanos también se ha encontrado una correlación elevada entre los resultados obtenidos de HOST y los de fecundación “in vitro” (Zaneveld y Jeyendran, 1990).

Los estudios sobre la permeabilidad al agua de algunas membranas de espermatozoides de mamíferos (carnero, humano) muestran que el coeficiente de permeabilidad al agua osmótica es muy alto y que la energía de activación asociada es muy baja, lo que sugiere una membrana porosa y la presencia de proteínas canales de agua. En estas especies, los transportadores de glucosa de estas membranas podrían tener una función de canal de agua secundario (Curry et al., 1995).

En semen ovino Oberst et al. (2003) evaluaron diferentes osmolaridades utilizando una solución hipoosmótica para semen fresco y los mejores resultados porcentuales de espermatozoides reactivos al test hipoosmótico fueron obtenidos con soluciones de osmolaridad en torno a 100-150 mOsm/L.

Oliveira Moura et al. (2010), evaluaron soluciones con diferente composición para realizar el test hipoosmótico para semen ovino, utilizando siempre una osmolaridad de 100 mOsm/L y 30 minutos de incubación, obteniendo el mejor resultado en semen fresco y refrigerado con una solución de fructosa-citrato sódico.

Santiani et al. (2004), evaluaron el tiempo de exposición del semen ovino fresco al test hipoosmótico, tomando la solución hipoosmótica que usaron Jeyendran et al. (1984) en humanos y establecieron tiempos de incubación con resultados significativos a partir de los 60 minutos.

En trabajos con semen de carnero congelado, Rivolta et al. (1995) y Boretto et al. (2002) utilizaron solución hipoosmótica de fructosa-citrato sódico con 100 mOsm/L, incubando 30 minutos.

II. 3. Preservación de semen ovino

II.3.1. Sensibilidad de la membrana del espermatozoide a los cambios de temperatura

Los espermatozoides de carnero, como los del bovino y cerdo, tienen susceptibilidad elevada al choque térmico, que esta correlacionado con una ratio (relación cuantitativa entre las dos magnitudes que refleja una proporción) elevada entre ácidos grasos poliinsaturados y saturados de 2,5-3,3 aproximadamente (los espermatozoides del hombre presentan una ratio de 1). Esta ratio tiene un efecto significativo en algunas propiedades de los sistemas de membrana (Poulos, Darin-Bennett and White, 1973). Respecto de esta sensibilidad al choque térmico se observó también, que, si la ratio colesterol/fosfolípidos es superior a 0,5, esta confiere una mayor resistencia al mismo. El colesterol existente en el espermatozoide de bovino y de carnero es la mitad del existente en el espermatozoide del humano (Darin-Bennett and White, 1977).

A la temperatura fisiológica, los fosfolípidos de membrana están en un estado fluido y sus cadenas de ácidos grasos son flexibles (De Leeuw, Colenbrander and Verkleij, 1990). Algunos lípidos no-bicapa, asumen una disposición hexagonal, alrededor de las proteínas de la membrana (Parks and Graham, 1992). Cuando la temperatura de la membrana disminuye por debajo de la temperatura de transición de cada uno de los fosfolípidos individuales que la componen, las cadenas de ácidos grasos toman rigidez y se aíslan en dominios de gel, de los cuales son excluidas las proteínas de la membrana que se concentran en áreas fluidas (De Leeuw, Colenbrander and Verkleij, 1990). Esto afecta las funciones de las proteínas, como ser en los canales proteicos iónicos (Watson, 2000). La conservación del semen a 5 ºC puede tener consecuencias perjudiciales como la disminución del 40% de la actividad metabólica del Na⁺/K+ intracelular, lo cual provoca disfunción en el paso de algunos iones a través de la membrana celular, afectando la sobrevivencia del espermatozoide (Vishwanathy and Shannon 2000).

El deterioro de la membrana espermática, reduce su capacidad para controlar la entrada de iones calcio, lo cual está asociado con la capacitación, hiperactivación y reacción acrosómica (Salomón y Maxwell, 2002).

II.3.2. Crioprotectores

La mayoría de las células no sobreviven a la congelación en ausencia de algún agente crioprotector. La incorporación de estas sustancias a la suspensión celular incrementa el porcentaje de supervivencia. Se establece, además, una interacción entre la concentración del crioprotector y la velocidad de enfriamiento (Watson, 1990).

Las sustancias crioprotectoras se incorporan al medio, y pueden ser penetrantes como el glicerol y el Dimetil Sulfóxido (DMSO) (Chenier et al., 1988) y no penetrantes como yema de huevo (Dauphas et al., 2006; Salomon y Maxwell, 2000), lactosa (Hammested et al., 1990) y lecitina de soja (de Paz et al., 2010; Forouzanfar, et al., 2010).

El glicerol es el más utilizado, actúa en el interior y exterior celular, aumenta el volumen de los espacios no congelados y diluye las concentraciones altas de sales >(Amann y Pichett, 1987).

Las sustancias crioprotectoras no penetrantes, como la lactosa y las lipoproteínas de la yema de huevo, actúan solo de forma extracelular (Hammested et al., 1990). Las células deben ser protegidas a bajas temperaturas mediante la adición de compuestos orgánicos como la leche descremada o la yema de huevo (Vishwanathy y Shannon, 2000) que aumentan la resistencia de la membrana a los cambios de permeabilidad e impiden que los espermatozoides intercambien calcio al alterarse el sistema de intercambio iónico de la membrana (Palomino et al., 2007).

Los crioprotectores en concentraciones elevadas son tóxicos para los espermatozoides y deben ser empleados manteniendo el equilibrio entre la protección máxima y la toxicidad mínima (Graham, 1996).

II.3.3. Refrigeración y congelación

En la refrigeración, la temperatura de la suspensión espermática se reduce desde los valores fisiológicos con los cuales es obtenida hasta 5 °C. Los espermatozoides son extremadamente sensibles a los descensos bruscos de temperatura, conocido como “shock por frio” (Parks, 1997), y a los cambios originados por la temperatura final alcanzada, denominados “daño por enfriamiento extremo” (Watson, 1990; 1995).

Si el enfriamiento es rápido, el espermatozoide manifiesta pérdida de la integridad de membrana y de las funciones celulares, en el rango de 20 a 0 ºC. En general, el daño resulta más severo entre 12 y 2 ºC (Watson, 1995). Las alteraciones pueden disminuirse utilizando velocidades de enfriamiento lentas (< 1 ºC/min) hasta cerca de los 4 ºC (Parks, 1997).

Durante la fase de enfriamiento hasta 5 ºC, se han detectado cambios similares a la capacitación o “criocapacitación” (Gillan et al., 1997; Cormier et al., 1997; Bailey et al., 2002).

En carneros para descender la temperatura del semen de 30 a 5 ºC y evitar que el choque por frío produzca efectos adversos, se emplean velocidades de refrigeración moderadas y homogéneas (-0,1 ºC/min. a -0,5 ºC/min.) (Vázquez et al., 1986). Cueto et al. (2011) utilizan un descenso de temperatura de 2 °C/3 min.

En ovinos, para inseminación con semen refrigerado se utiliza una dosis de 100-200 millones de espermatozoides en 0,1 ml (Aisen, 2004b; Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

Entre la refrigeración y la congelación, la muestra de semen diluida se mantiene a 5 °C para su equilibramiento, durante 2-4 horas (Aisen, 2004b; Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

En el proceso de congelación, cuando la temperatura desciende por debajo del punto de congelación, ocurre el fenómeno conocido como “supercooling”, antes de la formación de cristales de hielo. La cristalización libera calor residual que eleva la temperatura de la solución, lo cual puede tener efectos adversos sobre la célula (Graham, 1996).

La congelación debe ser rápida, pero la tasa de enfriamiento debe ser lo suficientemente lenta para permitir la salida de agua intracelular debido a la presión osmótica extracelular y prevenir la formación de cristales de hielo dentro de la célula, ya que son letales para la misma (Amann y Pichett, 1987; Graham, 1996). Durante la congelación parte del agua del solvente externo se empieza a congelar y aumenta la concentración de solutos (sales, proteínas y azúcares), por lo tanto, aumenta la osmolaridad del medio externo. Los solutos siguen disueltos y permanecen en fracciones no congeladas, cuyo volumen es importantes porque los espermatozoides presentes en las mismas son los que sobreviven a la criopreservación (Amann y Pichett, 1987). Las concentraciones de espermatozoides demasiado altas impiden que los mismos permanezcan en estas fracciones descongeladas y disminuye la supervivencia. El volumen y la relación superficie/volumen afectan la congelación; muestras con una relación superficie/volumen alto congelan en forma más uniforme que en aquellas donde la misma es menor. Las células de la superficie de la muestra se enfrían más rápidamente que las del interior por lo mismo en un volumen grande, la disparidad de congelación puede ser alta (Graham, 1996).

Si la congelación es muy lenta se forman cristales de hielo fuera de la célula que lesionan la membrana (Mazur, 1970). La célula se deshidrata por hiperosmolaridad del medio externo y aumenta la concentración intracelular (sales y macromoléculas), que lesiona las organelas, efecto conocido como “Shock osmótico” durante la descongelación (Mazur, 1970; 1984; Watson, 1995).

En la congelación espermática, la velocidad óptima va a depender de la especie, oscilando entre -10 y -80 ºC/min para los animales de abasto (Watson, 1995), siendo para el semen del carnero -50 a -60 ºC/min (Woelders, 1997).

La dosis inseminante de semen congelado que se utiliza en ovinos es 40-80 millones de espermatozoides en pajuelas de 0,25 ml (Aisen, 2004b; Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

El desafío del espermatozoide en el proceso de criopreservación lo constituye la franja de temperaturas entre 15 a -60 ºC, la cual afecta su integridad. Esta situación sucede en dos ocasiones, una durante el enfriamiento y otra durante la descongelación (Mazur, 1985).

II.3.4. Descongelamiento

Si las células fueron congeladas muy rápidamente, y luego se produce un calentamiento lento, se produce un fenómeno de “recristalización”, los microcristales formados en el interior de la célula tienden a agruparse y a formar cristales de mayor tamaño, con consecuencias letales (Mazur, 1985).

Las células congeladas de manera lenta, con un crioprotector penetrante, si son descongeladas demasiado rápido pueden sufrir “shock osmótico”, ante la imposibilidad de que el crioprotector abandone la célula lo suficientemente rápido como para mantener el equilibrio osmótico, con el consiguiente hinchamiento por efecto de la entrada de agua (Watson, 1990).

La velocidad de descongelación óptima entonces, depende de cómo se realizó el enfriamiento, pero debe representar una situación intermedia entre las dos posibilidades anteriores, con la que se minimicen los daños que se causen por inapropiadas velocidades de transporte de solutos y agua a través de las membranas, y por el agrupamiento de los microcristales de hielo intracelulares (Hammerstedt et. al, 1990).

Generalmente se utiliza una temperatura de descongelación de 36-37 °C, durante 15 segundos a 1 minuto (Aisen, 2004b; Palma, 2007; Cueto et al., 2011), logrando así los mejores resultados.

Capítulo III. Materiales y métodos

III. 1. Ubicación del estudio y animales utilizados

El estudio se realizó en el norte de la provincia de La Pampa, en la región central de la República Argentina. La zona norte pertenece a la llanura pampeana a 200 m. s. n. m., cuyo clima es templado húmedo con temperatura media anual entre 14 y 16 °C y precipitación media anual de 700 mm. La agricultura alterna con la explotación ganadera extensiva (Inventario integrado de los recursos naturales de la provincia de La Pampa, 2004).

Se utilizaron 20 carneros de diferentes denominaciones raciales, los cuales fueron 8 Corriedale, 8 Texel y 4 Pampinta, en edad reproductiva, mantenidos en pastoreo, basado en pasturas artificiales como alfalfa y rastrojos de avena o maíz (dependiendo la época). Los animales se encontraban en unidades productivas próximas a los 35° de latitud sur, de características ambientales y productivas semejantes.

III. 2. Trabajo de campo y muestreo

El muestreo se realizó en época reproductiva para la especie: marzo-mayo (servicio de otoño) y octubre-diciembre (servicio de primavera).

Los carneros fueron sujetados en decúbito lateral derecho de acuerdo con maniobras zootécnicas para garantizar el bienestar del animal y el de los operadores, y se les realizó el examen clínico general y reproductivo para constatar su aptitud clínica y sanitaria para la obtención de semen.

III.2.1. Colección y procesamiento de semen

Se realizó la higienización del prepucio con toalla de papel descartable. Para la obtención del eyaculado se utilizó un electroeyaculador (ePorvac, modelo e325, de origen argentino), con sonda rectal plástica de 40 cm de largo y 2 ½ pulgadas de diámetro, con tres electrodos longitudinales de bronce incrustados en la misma. Se pre estimuló a los animales con la sonda rectal sin conectar durante 30 segundos y luego se utilizó la curva programada, cuya potencia se incrementó linealmente desde 0,5 hasta 10 volts. Cada ciclo de estimulación consistió en un tiempo de estimulación de 2,0 segundos y de descanso de 1,5 segundos.

El semen se colectó en tubos Falcon de 50 ml estériles previamente atemperados a 37 °C, donde se observó el color, la consistencia (acuosa, lechosa o cremosa) y el volumen. Luego cada tubo se colocó en un baño termostático a 37 °C.

III.2.1.1. Evaluación de semen

Dentro de los 10 minutos posteriores a la extracción, se tomaron alícuotas de semen y a posteriori con un microscopio de contraste de fase (Leica modelo DM 2000, de origen alemán) se evaluó:

Motilidad masal: (microscopio 100x) se utilizó el siguiente criterio: grado 0 (no hay motilidad), 1 (algunos espermatozoides se mueven, pero la imagen general es de quietud), 2 (hay espermatozoides que se mueven, flujo lento, no hay ondas), 3 (formación de ondas sin conformación nítida), 4 (las ondas se forman y desaparecen en forma clara), 5 (las ondas se forman y desaparecen de forma tan rápida que no se pueden caracterizar).

Concentración espermática (espermatozoides/ml de semen): con cámara de Neubauer, utilizando una dilución 1:200 (400x), se contabilizaron los espermatozoides de cinco cuadrados delimitados por líneas triples, en dirección oblicua y se aplica la siguiente fórmula:

Motilidad espermática: (microscopio 400x), se determinó la proporción de espermatozoides con motilidad individual progresiva.

Vitalidad: con tinción Eosina-Nigrosina (1000x), se colocó sobre un portaobjetos atemperado en platina, 3 µl de semen y al lado 10 µl de cada colorante, ambos se homogenizaron y se dejaron 1 minuto, luego se realizó un extendido y se secó al aire. Se contabilizaron 200 células espermáticas y se calculó la proporción de vivos/muertos.

Morfología: en solución fisiológica formolada 0,3% (1000x). Se colocaron 0,3 µl de semen en 10 ml de solución. Se observó en 200 células integridad acrosomal, cabezas y colas (Aisen, 2004; Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

Test de Endósmosis (HOST): con este test se evaluó la integridad funcional de la membrana plasmática de los espermatozoides sobre la base de los trabajos realizados por Jeyendran, et al., 1984; Rivolta, et al., 1995; Oberst et al., 2003; Santiani et al., 2004 y Oliveira Moura et al., 2010. Se utilizó una solución compuesta por 490 mg de citrato de sodio y 900 mg de fructosa en 100 ml de agua destilada, de 100 mOsm/L. Se emplearon 10 µl de semen en 1000 µl de solución y un tiempo de incubación de 30 minutos, luego se fijó la muestra con 200 µl de la misma solución hipóosmotica formolada (0,3%). La lectura se realizó con microscopio de contraste de fase (200x), en base a 200 células espermáticas. El valor corresponde al número de espermatozoides HOST+ menos el número de espermatozoides con cola enroscada obtenido del análisis morfológico y se presentó en porcentaje.

Figura III.2.1.1. Test de Endósmosis: espermatozoide positivo (A), espermatozoide negativo (B).

III.2.1.2. Procesos de conservación del semen

La muestra de semen se dividió en tres partes, una fue mantenida en estado puro en baño termostático a 37 °C para su evaluación. Otra fue diluida en leche descremada esterilizada 10% (200 millones de espermatozoides/0,1 ml) a 37 °C, esta fracción fue refrigerada a 5 °C (Palma, 2007; Cueto et al., 2011).

Para la curva de descenso de temperatura se utilizó un refrigerador sin hielo portátil (Coleman NO. 5645), que trabajó a temperatura ambiente hasta alcanzar en su interior 5 °C. Luego de 12 horas, se realizó el procedimiento de evaluación descripto anteriormente para semen fresco, incluido el Test de Endósmosis.

La última porción de la muestra de semen fue diluida en Triladyl (80 millones de espermatozoides/pajuela de 0,25 ml) a 37 °C. Las pajuelas se llenaron de forma manual a temperatura ambiente (22-23 °C) y se sellaron con alcohol polivinílico. Finalmente, se las enfrió a 5 °C (de igual manera que el semen refrigerado), cuando alcanzo 5 °C se equilibró a esta temperatura durante 2,5 horas y criopreservó en vapores de nitrógeno (Palma, 2007; Cueto et al., 2011). Superados los 7 días, se descongelaron pajuelas en baño termostático a 37 °C, durante 1 minuto y se realizó el mismo procedimiento de evaluación de semen descripto anteriormente.

III.2.1.2.1. Curva de congelamiento del semen

El protocolo consistió en colocar las muestras de semen para refrigerar en su respectivo tubo plástico estéril de 15 ml y las pajuelas para congelar dispuestas en racks de plástico en un refrigerador sin hielo portátil (Coleman modelo NO. 5645) en el cual se realizó la curva de descenso de temperatura partiendo de una temperatura inicial equivalente al ambiente de 23-23,5 °C. Esto se implementó para evitar la práctica convencional de hacerlo en una heladera doméstica que en general detiene la curva y así no tener que proseguirla con puertas abiertas e incorporación de hielo al baño de agua que debe contener el recipiente con semen sin envasar o con pajuelas.

Cuando el refrigerador alcanzo los 5 °C, las muestras se trasladaron a una heladera domestica a la misma temperatura, en la que se realizó el equilibramiento durante 2,5 horas. Luego la fracción correspondiente se congelo con nitrógeno líquido de forma manual, utilizando una conservadora de Telgopor de 39,5 x 25 cm de lado y 25 cm de alto. En la misma se vertió nitrógeno líquido hasta los 6 cm de altura desde el piso y se utilizó un primer nivel de exposición de las pajuelas a los vapores de 19 cm por sobre la base, en el cual permanecieron 2 minutos y un segundo nivel de 9 cm con 3 minutos de permanencia. Luego se colocaron en un canastillo con nitrógeno líquido y en este se depositaron en un termo de nitrógeno para su conservación.

III.3. Análisis estadístico

Se obtuvo información de veinte eyaculados individuales para las variables de calidad de semen: Motilidad espermática (ME); % de espermatozoides vivos (%Vivos); % de espermatozoides positivos al Test de Endósmosis (HOST+) del semen fresco (SF), semen refrigerado (SR) y semen congelado (SC) respectivamente, en dos evaluaciones sobre cada muestra. Se realizó análisis de correlación lineal de Pearson entre dichas variables y tratamientos.

Se utilizaron medidas de resumen de motilidad espermática (ME), % de espermatozoides vivos (%Vivos) y % espermatozoides positivos a HOST en SF, SR Y SC.

Para el análisis de varianza, se realizó una exploración y el grupo racial no implicaba diferencias significativas para la variable HOST+, tampoco así la estación del año y no mejoraba el modelo que se describe a continuación.

Se clasificó a los eyaculados de acuerdo con los valores porcentuales de HOST+ obtenidos en el semen fresco, ≥70 (A), ≥ 60 (B), ≥ 50 (C), ≥ 40 (D), ≥ 30 (E), ≥ 20 (F), ≥10 (G), como referencia del estatus dentro de la prueba. Se utilizó un modelo general mixto heterocedástico dado por la clasificación de HOST+ del semen fresco x el tratamiento de preservación:

HOST = μ + clasificación de HOST+ del semen fresco + tipo de proceso + clasificación de HOST+ del semen fresco x tipo de proceso.

Se utilizó como efecto aleatorio la edad y el carnero. La comparación de medias se representó con gráfico de puntos.

Se realizó regresión lineal simple para HOST+ (variable regresora) del semen fresco y HOST+ del semen refrigerando (variable dependiente), al igual que para semen congelado.

Capítulo IV. Resultados

IV.1. Medias de resumen de las variables de calidad de semen

En la evaluación de semen con diferentes tratamientos de preservación, HOST+ resulto en semen fresco con una media 47,96% cuyo valor máximo es 75% y mínimo 14,28%. En semen refrigerado 37,59%, máximo 72,83% y mínimo 11%. Para semen congelado la media fue 15,72%, con valor máximo 31,57% y mínimo 0% (Tabla IV.1.1.).

Tabla IV.1.1. Medidas de resumen para las variables de Motilidad, Vitalidad y Test de Endósmosis en muestras de semen fresco, refrigerado y congelado

ME

% Vivos

HOST+

SF

SR

SC

SF

SR

SC

SF

SR

SC

Media (%)

68,25

50,00

34,25

55,48

40,87

29,44

47,96

37,59

15,72

Desvió Estándar

7,66

11,70

15,15

13,09

13,86

15,11

17,81

18,79

10,75

Error Estándar

1,71

2,62

3,39

2,93

3,10

3,38

3,98

4,20

2,40

Mediana

70,00

50,00

40,00

60,73

41,00

33,99

50,00

37,04

15,66

Valor mínimo

50,00

20,00

5,00

25,94

14,43

0,00

14,28

11,00

0,00

Valor máximo

80,00

70,00

60,00

73,68

61,27

54,40

75,00

72,83

31,57

Coeficiente de variación

11,22

23,40

44,25

23,60

33,91

51,34

37,13

49,98

68,39

Estado del semen: semen fresco (SF), semen refrigerado (SR) y semen congelado (SC).

Motilidad espermática (ME); % de espermatozoides vivos (%Vivos); % espermatozoides positivos al Test de Endósmosis (HOST+).

IV.2. Correlación entre las variables de calidad de semen

Cuando se analizó la motilidad espermática (ME) con el % de espermatozoides positivos al Test de Endósmosis (HOST+), se encontró correlación lineal entre ambos, tanto para semen fresco como para semen refrigerado y congelado. También se observó correlación media de la ME del semen fresco con el HOST+ del semen refrigerado (r= 0,54) y descongelado (r= 0,60) (Tabla IV.2.1.).

Tabla IV.2.1. Coeficientes de correlación para las variables de Motilidad, Vitalidad y Test de Endósmosis en muestras de semen fresco, refrigerado y congelado

SF

% Vivos

SR

% Vivos

SC

% Vivos

SF

HOST+

SR

HOST+

SC

HOST+

SF ME

0,86***

0,63**

0,53*

0,70***

0,54**

0,60**

SR ME

0,78***

0,70***

SC ME

0,94***

0,87***

SF %Vivos

0,64**

0,49*

0,62**

0,52*

0,66**

SR %Vivos

0,83***

SC %Vivos

0,81***

SF HOST+

0,67**

0,60**

0,83***

0,51***

Estado del semen: semen fresco (SF), semen refrigerado (SR) y semen congelado (SC). Variables de calidad de semen: Motilidad espermática (ME); % de espermatozoides vivos (%Vivos); % de espermatozoides positivos al Test de Endósmosis (HOST+). *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001.

IV.3. Comparación de medias de espermatozoides positivos al test de endósmosis (HOST) en semen refrigerado y descongelado en respecto del semen fresco

Los eyaculados clasificados según el rango de respuesta a HOST, en la comparación de medias presentaron diferencias significativas entre los mismos (p < 0,001), a excepción de los ≥ 60 y 70 HOST+ (Gráfico IV.3.1.).

En el semen refrigerado la comparación de medias de HOST+, permite apreciar las diferencias de respuesta del mismo a esta prueba, en referencia a la clasificación por valores de las muestras frescas respectivas (Gráfico IV.3.1.).

Estado del semen: semen fresco (SF), semen refrigerado (SR) y semen congelado (SC). Clasificación de los eyaculados de acuerdo con los valores porcentuales de espermatozoides positivos a HOST del semen fresco: ≥ 70 (A), ≥ 60 (B), ≥ 50 (C), ≥ 40 (D), ≥ 30 (E), ≥ 20 (F), ≥ 10 (G). Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p < 0,05).

Gráfico IV.3.1. Porcentajes de espermatozoides positivos al Test de Endósmosis (HOST+) en semen fresco, refrigerado y descongelado en función de la categorización de HOST+ del semen fresco

La comparación de medias en semen congelado no demostró diferencias significativas para el porcentaje de HOST+, respecto del porcentaje de HOST+ que tenían las muestras frescas respectivas (comprendidas entre ≥ 20 y ≥ 70) (Gráfico IV.3.1.).

IV. 4. Regresión lineal para refrigerado y congelado en función del semen fresco

Se realizó una regresión lineal para HOST+ del semen refrigerando en función de HOST+ del semen fresco, la cual resultó: R²= 0,67. Esto indica que el 67% de la variabilidad del HOST+ en semen refrigerado es explicada por la variable regresora HOST+ del semen fresco, p < 0,001. Lo cual implica que hay relación entre HOST+ en semen fresco y HOST+ del mismo semen luego de ser refrigerado.

Se realizó una regresión lineal para HOST+ del semen congelado en función de HOST+ del semen fresco, la misma resultó: R²= 0,22. Esto indica que el 22% de la variabilidad del HOST+ en semen congelado es explicada por la variable regresora HOST+ del semen fresco, p < 0,05. Lo cual demuestra que la relación entre HOST+ en semen fresco y HOST+ del mismo semen luego de ser refrigerado no es suficientemente amplia.

Capítulo V. Discusión

La motilidad espermática presenta correlación positiva significativa con el HOST, tanto para semen fresco como para semen descongelado, al igual que en trabajos preexistentes (Rivolta et al., 1995) en los cuales, incluyendo pruebas de filtración por columnas, concluyeron que en una población existen cuatro categorías: espermatozoides motiles con y sin integridad de membrana, y espermatozoides no motiles con y sin integridad de membrana. A diferencia de Rivolta et al. (1995) y de Boretto et al. (2002), el coeficiente de correlación fue menor en semen fresco (r= 0,70) y mayor en semen descongelado (r= 0,87). En este trabajo además se incluyó el análisis de semen refrigerado obteniéndose una correlación de r= 0,70. Trabajos previos (Rivolta et al., 1995; Boretto et al., 2002; Santiani et al. 2004; Fischman et al., 2007; Hernández y Carrillo-González, 2015) obtuvieron correlación entre el HOST y la motilidad espermática dentro de la muestra en el mismo estado de tratamiento (fresca, refrigerada o congelada). En este trabajo se pudo observar una correlación media de la motilidad espermática del semen fresco (que es la que se evalúa en primera instancia para decidir su destino) con el HOST en semen refrigerado (r= 0,54) y descongelado (r= 0,60). Debido a que la motilidad espermática no es una prueba objetiva de evaluación espermática y no incluye la valoración de la funcionalidad de membrana, indispensable para su capacidad fecundante, entendiendo además que hay espermatozoides motiles con y sin integridad de membrana y viceversa (Rivolta et al., 1995), y que algunos trabajos han obtenido coeficientes de correlación bajos (r= 0,18) entre motilidad y fecundidad (Santiani et al., 2004), se requiere una prueba más objetiva, la cual podría ser el HOST.

Situaciones similares a las descriptas para motilidad espermática, suceden con las tinciones supravitales, que solamente determinan la integridad morfológica pero no funcional de la membrana.

En este trabajo se encontraron diferencias significativas entre los eyaculados de los diferentes carneros para el HOST. Otros autores (Hernández y Carrillo-González, 2015) no encontraron diferencias significativas cuando utilizaron eyaculados de los mismos individuos. Mientras algunos trabajos, para semen fresco obtuvieron valores de HOST 68,8%; 61,2 ±6,9%; 71,8 ±18,9%; 80,47 E. E. 1,28% respectivamente (Rivolta et al., 1995; Santiani et al., 2004; Oliveira Moura et al., 2010; Hernández y Carrillo González, 2015), en este trabajo resulto menor, como sucedió también en semen refrigerado que fue 37,59±18,79%, mientras que otros autores obtuvieron 57,4 ±20,7% (Oliveira Moura et al., 2010).

En semen descongelado el HOST resulto en valores medios menores que en otros trabajos que obtuvieron 37% (Rivolta et al., 1995), 35,5% (min. 27,6%-máx. 50,5%) (Boretto et al., 2002) y 25,1% (min. 11%-máx. 44%) (Fischman et al., 2007). Si bien habría que conocer todos los desvíos y errores estándar para ampliar el análisis, las diferencias entre los valores obtenidos entre trabajos podrían deberse a diferencias en las características de los animales en cuanto a raza, el hábitat de los mismos y los protocolos empleados para la obtención y el procesamiento del semen.

Si bien todos los trabajos mencionados (Rivolta et al., 1995; Santiani et al., 2004; Oliveira Moura, et al., 2010) coinciden en los parámetros (estándares) de la técnica de HOST para semen ovino, uno de ellos se diferencia en los componentes y osmolaridad de la solución, temperatura y tiempo de incubación (Hernández y Carrillo-González, 2015). Este estudio, además de diferenciarse en la heterogeneidad de denominaciones raciales incluidas, coincide solo con uno de los trabajos (Oliveira Moura et al., 2010) en la obtención del valor del HOST utilizando la fórmula en la cual al % de espermatozoides positivos a HOST se le resta el % de espermatozoides con alteraciones en la cola (dato extraído de la observación morfológica).

Este trabajo demuestra que, para las condiciones descriptas, el HOST puede brindar información objetiva y confiable para semen refrigerado ya que el 67% de la variabilidad del HOST + en el mismo es explicada por la variable regresora HOST+ del semen fresco (p < 0,001). Lo que demuestra que hay relación entre HOST+ en semen fresco y HOST+ luego de ser refrigerado.

En semen congelado, el 22% de la variabilidad del HOST+, es explicada por la variable regresora HOST+ del semen fresco (p < 0,05). Esto demuestra que la relación entre HOST+ en semen fresco y HOST+ del mismo semen luego de ser descongelado no es suficientemente amplia como para ser utilizarse como indicador de la calidad seminal post-descongelación.

Capítulo VI. Conclusión

En este trabajo se ha determinado que la motilidad espermática del semen fresco, la cual se evalúa en las primeras instancias post-extracción para decidir su utilización, estuvo ligeramente asociada con el porcentaje de espermatozoides positivos al Test de Endosmosis del semen refrigerado y descongelado. Así como también lo estuvo la vitalidad.

Se pondera la utilidad del Test de Endosmosis como prueba de evaluación funcional de los espermatozoides, sobre la base de la información que brinda respecto de las otras pruebas de análisis de calidad de semen ovino, por lo tanto, su incorporación rutinaria a éste.

Considerando el protocolo de preservación utilizado, es posible inferir parámetros de calidad del semen refrigerado a través de la respuesta positiva al Test de Endosmosis en semen fresco. La calidad del semen post criopreservación (descongelado) varía en relación a la calidad del semen fresco. No obstante, el Test de Endósmosis no resultó un indicador útil para inferir la calidad del semen criopreservado en carneros.

Se estima que la calidad del semen congelado,> es inherente a su vez a otras variables que estarían relacionadas a la idiosincrasia del carnero y al protocolo de criopreservación.

Capítulo VII. Bibliografía

Aisen, E. G. (2004a). Recolección y evaluación de semen. En: Aisen E. G. (1era ed.), director. Reproducción Ovina y Caprina. (pp. 55-69). Buenos Aires: Inter-Médica.

>Aisen, E. G. (1era ed.). (2004b). Reproducción Ovina y Caprina. Buenos Aires: Inter-Médica. 216 p.

Amann, R. y Pickett, B. (1987). Principles of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa. Journal of equine veterinary science, 7(3), 145-173.

Ávalos Rodríguez, A., González Santos, J. A., Vargas Ibarra, A. K. y Herrera Barragán, J. A. (1era ed.). (2018). Recolección y manipulación seminal in vitro. México. Universidad Autónoma Metropolitana. 57 p.

Bailey, J., Morrier, A. y Cormier, N. (2002). Semen cryopreservation: successes and persistent problems in faro species. En Amino Acids: Meat, Milk and More! Improving Animal Production with Reproductive Physiology. (pp. 86-95). Quebec: Canadian Society of Animal Science.

Beltrán de Heredia, I. (2009). Reproducción y control reproductivo en el macho. En Ovinotecnia (Producción y Economía de la Especie). (pp. 105-114). Eds: Sañudo, C., Cepero Briz, R. Prensas Universitarias de Zaragoza. Zaragoza, España.

BIOTECNOLOGÍA. Boletín Estadístico Tecnológico. (2010). Recuperado de https://docplayer.es/3960694-Biotecnologia-b-o-l-e-t-i-n-e-s-t-a-d-i-s-t-i-c-o-te-c-n-o-l-o-g-i-c-o.html

Boland, M., Al-Kamalia, A., Crosbya, T., Haynesb, B., Howlesb, C., Kellehera, D. y Gordona, I. (1985). The influence of breed, season and photoperiod on semen characteristics, testicular size, libido and plasma hormone concentrations in rams. Animal Reproduction Science, 9: 241-252.

Boretto, J. M., Gibbons, A. E., Bunge, M. M., Cueto, M. I. y Bidinost, F. (2002). Calidad seminal pos-descongelamiento en relación con la eficiencia reproductiva de la inseminación artificial laparoscópica en ovinos. Revista de Medicina Veterinaria, 83: 185-188.

Caiza de la Cueva, F. I. (1998). Estudio sobre la resistencia al estrés osmótico de espermatozoides porcinos y equinos. Tesis doctoral, Universidad Autónoma de Barcelona, España. 128 p.

Chenier, T., Merkies, K, Leibo, S., Plante, C. y Johnson, W. (1998). Evaluation of Cryoprotective agents for Use in the Cryopreservation of Equine Spermatozoa. AAEP Proceedings, 44: 5-6.

Colas, G. y Zinsner, F. (1975). Production spermatique et croissance testiculaire chez l´agneau de race Ile de France et Prealpes. Journées de Recherche Ovine et Caprine, 1: 235-243.

Colas, G. (1980). Variations saisonnières de la qualité du sperme chez le belier Ile-de-France. 1. Etude de la morphologie cellulaire et de la motilité massale. Reproduction Nutrition Development, 20(6), 1789-1799.

Cooper, T. G. (1era ed.). (1986). The epididymis, sperm maduration and fertilisation. Heidelberg, Alemania: Springer verlag. 281 p.

Cormier, N., Sirard, M. A. y Bailey, J. L. (1997). Premature capacitation of bovine spermatozoa is initiated by criopreservation. Journal Andrology, 18: 461- 467.

Correa, J. R. y Zavos, P. M. (1994). The hipoosmotic swelling test: its employment as an assay to evaluate the functional integrity of the frozen-thawed bovine sperm membrane. Theriogenology, 42: 351-360.

Cueto, M., Gibbons, A., García Vinent, J., Wolff, M. y Arrigo, J. (2011). Obtención, procesamiento y conservación del semen ovino. Reproducción y Genética. Bariloche, Argentina: Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. 14 p.

Curry, M. R., Millar, J. D. y Watson, P. F. (1995). The presence of water cannel proteins in ram and human sperm membranes. Journal Reproductive Fertil, 104: 297-303.

Darin-Bennett, A. y White, I. G. (1977). Influence of the cholesterol content of mammalian spermatozoa on susceptibility to cold-shock. Cryobiology, 14: 466-70.

Dauphas, S., Beaumal, B., Riaublanc, A. y Anton, M. (2006). Hen Egg Yolk Low-Density Lipoproteins Film Spreading at the Air-Water and Oil-Water Interfaces. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54: 3733-3737.

De Leeuw, F. E., Colenbrander, B. y Verkleij, A. J. (1990). The role membrane plays in cold shock and freezing injury. Reproduction in Domestic Animal, 1: 95-104.

de Paz, P., Esteso, M., Alvarez, M., Mata, M., Chamorro, C. y Anel, L. (2010). Development of extender based on soybean lecithin for its application in liquid ram semen. Theriogenology, 74(4), 663-671.

Delgadillo, J. A. (2004). Características anatómicas y funcionales del sistema reproductor del macho. En: Aisen, E. G. Reproducción Ovina y Caprina. (pp. 1-9). 1era ed. Buenos Aires, Argentina: Inter-Medica.

Evans, G. y Maxwell, W. M. C. (1era ed.). (1990). Salamon´s Artificial Insemination of Sheep and Goats. United Kingdon: Butterworth. 208 p.

Fischman, M. L., Campi, S., González, L., Blasi, C., Ghirardi, M. P., Veksler, J. y Cisale, H. (2007). Valoración de la calidad seminal en semen ovino congelado de entre 9 y 15 años de antigüedad. Vº Congreso de Especialistas en Pequeños Rumiantes y Camélidos Sudamericanos, Mendoza, Argentina. Sitio Argentino de Producción Animal, 1-3. Recuperado de http://www.produccion-animal.com.ar/produccion_ovina/inseminacion_ovinos/10-fischman_semen.pdf

Folch, J. (2000). Manejo del morueco. En: XXV Jornadas Científicas SEOC, Producción ovina y caprina. (pp. 61-64). España: Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia SEOC.

Forouzanfar, M., Sharafi, M., Hosseini, S., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Hosseini, L., Abedi, P., Nili, N., Rahmani, H. y Nasr-Esfahani, M. (2010). In vitro comparison of egg yolk-based and soybean lecithin-based extenders for cryopreservation of ram semen. Theriogenology, 73: 480-487.

Gadea, J., Matás, C. y Lucas, X. (1998). Prediction of porcine semen fertility by homologous in vitro penetration (hIVP) assay. Animal Reproduction Science, 56: 95-108.

Galaz-Leiva, S., Pérez-Rodríguez, G., Blázquez-Castro, A. y Stockert, J. C. (2012). A simplified chromatin dispersion (nuclear halo) assay for detecting DNA breakage induced by ionizing radiation and chemical agents. Biotech Histochem, 87: 208-217.

García Artiga, C., Garde, J., Pérez Fuentes, J., Martínez, E. y Vázquez, I. (1994). Correlaciones entre distintos parámetros utilizados a nivel de laboratorio para determinar la calidad del semen de morueco. (pp. 86-89). VII Jornadas Internacionales de Reproducción Animal. Murcia, España: Asociación española de Reproducción Animal.

Gibbons, A. y Cueto, M. (2011). Manual de inseminación artificial en la especie ovina. Reproducción y Genética. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Bariloche, Argentina. 19 p.

Gibbons, A., Cueto, M., Wolff, M., Arrigo, J. y García, J. (2004). Obtención, procesamiento y conservación del semen ovino. Comunicación técnica PA 200. INTA. EEA Bariloche, Chile.

Gillan, L., Evans, G. y Maxwell, W. M. C. (1997). Capacitation status and fertility of fresh and frozen-thawed ram spermatozoa. Reproduction Fertility and Development, 9: 481-487.

Giuliano, S., Director, A., Trasorras, V., Maizon, D. y Miragaya, M. (2006). Membrane integrity and function in fresh and cooled Lama glama semen. Biocell, 30(1), 231.

Glover, T. D. (1era ed.). (1990). Human Male Fertility and Semen Analysis. London: Academic Press. 247 p.

Graham, J. K. (1996). Cryopreservation of stallion spermatozoa. Veterinary Clinics of North America: Equine, 12: 131-145.

Gravance, C. G., Champion, Z. J. y Casey, P. J. (1998). Computer-assisted sperm head morphometry analysis (ASMA) of cryopreserved ram spermatozoa. Theriogenology, 49: 1219-1230.

Hafez, E. S. E. (7ma ed.). (2002). Reproducción e inseminación artificial en animales. México: Interamericana-McGraw Hill. 519 p.

Hafez, E. S. E. (2002). Evaluación seminal. En: Hafez, E. S. E. (7ma ed.). Reproducción e inseminación artificial en animales. (pp. 75-385). México: Interamericana-McGraw Hill.

Hammerstedt, R. H., Graham, J. K., Nolan, J. P. (1990). Cryopreservation of mammalian sperm: What we ask them to survive. Journal of Andrology, 11(1), 73-88.

Hernández, D. y Carrillo González, D. (2015). Aplicación del test hipoosmótico (HOST) en la evaluación de calidad seminal en ovinos criollos de pelo colombiano. AICA, 165-171.

Inventario integrado de los recursos naturales de la provincia de La Pampa. (2004). Recuperado de https://recursosnaturales.lapampa.edu.ar//pdfs/caracterizacion.pdf

Jeyendran, R., Van Der Ven, H., Pérez Peláez, M., Crabo, B. y Zaneveld, L. (1984). Development on an assay to assess the functional integrity of the human sperm membrane and its relationship to the semen characteristics. Journal Reproduction and Fertility, 70: 219-228.

Langeveldt, J. (2016). A comparison of Merino and Dormer rams in terms of mating dexterity and sperm subpopulations characteristics. Doctoral dissertation, Stellenbosch: Stellenbosch University.

Mazur, P. (1970). Cryobiology: the freezing of biological systems. Science, 168: 939-49.

Mazur, P. (1984). Freezing of living cells: mechanisms and implications. Journal Physiology, 247: 125-142.

Mazur, P. (1985). Basic concepts in freezing cells. En: Johnson, L. A. y Larsson, K. (1era ed.). “Deep freezing of boar semen”. (pp. 91-111). Uppsala, Suecia: Swedish university of agricultural sciences.

Ministerio de Ciencia, Tecnología e Innovación Productiva de la Nación. Recuperado de http://www.mincyt.gob.ar/ministerio/ministerio-100

Mortimer, S. T. (2000). CASA practical aspects. Journal of Andrology, 21: 515-524.

Oberst, E. R., Jobim, M. I. M., Mattos, R. C., Kroth, E., Lara, G., Smiderle, W. y Bronzatto, M. (2003). Teste hiposmótico e sua relação com outros métodos da avaliação da integridade da membrana espermática de carneiro. Revista Brasileira de Reprodução Animal, 27: 375-376.

Oliveira Moura, L. C., Corona da Silva, M. y das Neves Snoeck, P. P. (2010). Diferentes soluções de teste hiposmótico para sêmen ovino. Revista Brasileira de Medicina Veterinária, 32(3), 146-150.

Padrón, R., Fernández, G. y Gallardo, M. (1998). Interpretación del análisis seminal. Revista Cubana de Endocrinología, 9(1), 81-90.

Palma, G. A. (2007). Curso de congelación de semen ovino. Recuperado de http://www.reprobiotec.com/

Palomino, J. M., Cervantes, M., Rodríguez, A., Cisneros, F. y Huanca, W. (2007). Efecto de dos dilutores y tiempo de refrigeración sobre la motilidad individual de semen refrigerado de caprinos. APPA-ALPA. Cuzco, Perú. Sitio Argentino de Producción Animal, 1-3. Recuperado de https://www.produccion-animal.com.ar/produccion_caprina/inseminacion_transferencia_caprino/22-Palomino-SemenCaprino.pdf

Parks, J. E. y Graham, J. K. (1992). Effects of cryopreservation procedures on sperm membranes. Theriogenology, 38: 209-222.

Parks, J. E. (1997). Hypothermian and mammalian gametes. En: Karow, A. M. y Critser, J. K. (1era ed.). “Reproductive tissue banking: scientific principles”. (pp. 229-261). San Diego, EEUU: Academic Press.

Pérez y Pérez F. (1985). Reproducción Animal: Inseminación Artificial y Trasplante de Embriones. Barcelona, España: Científico Médica. 900 p.

Pérez Llano, B., Sánchez, R., Lorenzo González, J. L y García Casado, P. (1998). A short version of the osmotic resistance test for boar semen. (pp. 61). Proceedings of the 15th IPVS Congress. Birmingham, England: International Pig Veterinary Society.

Poulos, A., Darin-Bennett, A. y White, I. G. (1973). The phospholipid-bound fatty acids and aldehydes of mammalian spermatozoa. Comparative Biochemistry and Physiology, 46B: 541-549.

Ramos, L., Hendriks, J. C., Peelen, P., Braat, D. D. y Wetzels, A. M. (2002). Use of computerized karyometric image analysis for evaluation of human spermatozoa. Journal Andrology, 23: 882-888.

Rivolta, M., Cisale, H., Guidoni, J. y Fernández, H. (1995). Uso del Test de Endósmosis en semen descongelado ovino y bovino. Revista Veterinaria Argentina, 12(119), 602-605.

Rodríguez Gil, J. E., Montserrat, A. y Rigau, T. (1994). Effects of hypoosmotic incubation on acrosome and tail structure on canine spermatozoa. Theriogenology, 42: 815-829.

Salamon, S. y Maxwell, W. (2002). Storage of ram semen. Animal Reproduction Science, 62: 77-111.

Santiani, A., Sandoval, R., Ruiz, L. y Coronado, L. (2004). Estudio de la integridad de membrana en espermatozoides de ovino mediante la prueba de estrés hipoosmótico. ResearchGate. Recuperado de https://www.researchgate.net/publication/272892372_Estudio_de_la_integridad_de_membrana_en_espermatozoides_de_ovino_mediante_la_prueba_de_estres_hipoosmotico

Soler, C., Pérez-Sánchez, F., Schulze, V., Bergmann, M., Oberpenning, F., Yeung C. H. y Cooper, T. G. (2000). Objective evaluation of the morphology of human epididymal sperm heads. International Journal of Andrology, 23: 77-84.

Suttiyotin, P. y Thwaites, C. J. (1992). Comparison of a swim-up technique with Hamilton Thorn Motility Analyser for measurement of sperm velocity and motility. Reproduction Fertility Development, 4(2), 153-160.

Vázquez, L., Martínez, F., Alcaide, M. y Diazvubero, C. (1986). Congelación del semen de morueco. (pp. 169-176). XI Jornadas Científicas de la SEOC. Madrid, España: Sociedad Española de Ovinotecnia y Caprinotecnia SEOC.

Vásquez C. J. H., Florentini, E. A., Camargo, L. A. y Valdivia, C. (2011). Test hipoosmótico en espermatozoides epididimarios de ovinos (Ovis aries). SPERMOVA, 1: 119-120.

Verstegen, J., Iguer-Ouada, M. y Onclin, K. (2002). Computer assisted semen analyzer in andrology research and veterinary practice. Theriogenology, 57: 149-179.

Vishwanath, R. y Shannon, P. (2000). Storage of bovine semen in liquid and frozen state. Animal Reproduction Science, 62: 23-53.

Watson, P. F. (1990). Artificial insemination and the preservation of semen. En: Lamming, G. E. (4ta ed. Vol. 2). “Marshall´s physiology of reproduction: Reproduction in the male”. (pp. 747-869). New York, EEUU: Churchill Livingstone.

Watson, P. F. (1995). Recent developments and concepts in the cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. Reproduction Fertility and Development, 7: 871-891.

Watson, P. F. (2000). The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal Reproduction Science, 60-61: 481-492.

Vishwanath, R. y Shannon, P. (2000). Storage of bovine semen in liquid and frozen state. Animal Reproduction Science, 62: 23-53.

Woelders, H. (1997). Fundamentals and recent development in cryopreservation of bull and boar semen. Veterinary Quarterly, 19: 135-138.

Yanagimachi, R. (1994). Mammalian fertilization. En: Knobil, E. y Neill, J. D. (2da ed.). The physiology of reproduction. (pp. 189-317). New York: Raven Press Ltd.

Zaneveld, L. J. D. y Jeyendran, R. S. (1990). Hypoosmotic swelling test. En: Keel, B. A. y Webster, B. W. (1era ed.). “Handbook of the laboratory diagnosis and treatment of infertility”. (pp. 91-110). Florida, EEUU: CRC press, Boca Ratón.

Capítulo VIII. Anexos

ANEXO 1: Equipo, trabajo a campo y análisis de muestras

VIII.1.1. Equipo de trabajo

Figura VIII.1.1.1. Integrantes del equipo de trabajo

IX.1.2. Laboratorios

Figura VIII.1.2.1. Laboratorio de campo y laboratorio de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLPam

IX.1.3. Registro de protocolo de campo y laboratorio

Figura VIII.1.3.1. Libro de registro de protocolo y resultados

ANEXO 2: Enfriamiento de semen ovino

VIII.2.1. Curva de descenso de temperatura en el enfriamiento del semen

ANEXO 3: Regresión lineal para semen fresco, refrigerado y congelado

Tabla VIII.3.1. Análisis de regresión lineal con porcentaje de espermatozoides positivos al Test de Endósmosis del semen fresco y semen refrigerado.

Variable

N

R²

R2 Aj

ECMP

AIC

BIC

HOST+ SR

20

0,69

0,67

140,12

155,91

158,90

Coef

Est.

E.E.

P-valor

const

-4,31

7,11

0,5516

HOST+ SF

0,87

0,14

< 0,0001

Porcentaje de espermatozoides positivos al Test de Endósmosis del semen refrigerado (HOST+ SR), Porcentaje de espermatozoides positivos al Test de Endósmosis del semen fresco (HOST+ SR).

Tabla VIII.3.2. Análisis de regresión lineal con porcentaje de espermatozoides positivos al Test de Endósmosis del semen fresco y semen congelado.

Variable

N

R²

R2 Aj

ECMP

AIC

BIC

HOST+ SC

20

0,26

0,22

110,79

150,77

153,76

Coef

Est.

E.E.

P-valor

const

1,02

6,25

0,8717

HOST+ SC

0,31

0,12

< 0,0223

Porcentaje de espermatozoides positivos al Test de Endósmosis del semen refrigerado (HOST+ SR), Porcentaje de espermatozoides positivos al Test de Endósmosis del semen fresco (HOST+ SR).